双擎驱动 洞见多维 | 基于CytoFLEX mosaic的40色全光谱免疫表型分析方案

图3（上下滑动阅览）：手动设门策略。用于识别主要免疫细胞亚群的设门策略通过箭头说明绘图之间的关系，并通过编号标签对应下面描述的人群。在排除双联体和碎片后，嗜碱性粒细胞（1）被鉴定为CD45?CD123?HLA-DR?。淋巴细胞和单核细胞（2）根据FSC-A和SSC-A特性设门。单核细胞（3）根据CD14和CD16表达进一步分为经典（CD14??CD16?）、中间（CD14??CD16?/low）和非经典（CD14?CD16?）亚群。从淋巴细胞门（2）中，区分出三个群体：CD3?TCRγδ?、CD3?TCRγδ?和CD3?TCRγδ?（4）。CD3?TCRγδ?亚群（5）根据CD45RA和CCR7表达进一步表征。CD3?TCRγδ?群体被分为CD3?CD56?（NK T样）和CD3?CD56?亚群（6），并使用CD2和CD8表达对NK T样细胞进行额外分类（7）。从CD3?TCRγδ?门中，鉴定出CD4?、CD8?、CD4?CD8?和CD4?CD8? T细胞（8）。调节性T细胞（Tregs）从CD4?群体中通过CD127low和CD25high表达设门，并使用CD39和CD45RA进一步表征（9）。使用CCR7、CD45RA、CD27和CD28定义CD4?和CD8? T细胞的记忆和效应亚群（10, 11）。B细胞在CD3?TCRγδ?群体中被鉴定为CD19?和/或CD20?（12）。它们被进一步分类为IgD?CD27?（初始B细胞）、IgD?CD27?（未转换记忆B细胞）和IgD?CD27?亚群。IgD?CD27?群体根据CD20表达细分为浆母细胞和IgD?记忆B细胞，并在记忆区室内评估了IgG和IgM表达（13）。自然杀伤（NK）细胞被定义为CD3?TCRγδ?HLA-DR?，并分类为早期（CD56??CD16?）、成熟（CD56?CD16?）和终末（CD56?CD16?）亚群（14）。树突状细胞（DCs, 15）被鉴定为CD3?CD19?CD56?CD14?HLA-DR?，并进一步分离为浆细胞样树突状细胞（CD123?）和经典树突状细胞（CD11c?）。CD11c? DCs进一步分为CD16?和CD16?亚群，然后使用CD1c和CD141表达进行分类。最后，固有淋巴样细胞（ILCs, 16）被定义为CD3?CD19?CD20?CD14?CD123?CD127?，并根据CD2和CD4表达进一步分亚群。所有呈现的数据均来自一个有代表性的健康供体。

图4（上下滑动阅览）：通过优化活/死染色前的洗涤条件改善CXCR3和CXCR5染色。顶行（A–F）：裂解的血样用PBS洗涤，然后用ViaKrome 808染色进行活/死鉴别，随后用含1% FBS的PBS洗涤进行荧光标志物染色。图B和图C分别显示CXCR5和CXCR3的单染对照。图D显示在无蛋白缓冲液中用ViaKrome单染的活/死细胞；图E显示CD3?CD4? T细胞，图F显示多色样本中CXCR5和CXCR3表达降低。底行（G-L）：在ViaKrome染色前，细胞用含1% FBS的PBS洗涤，这恢复了CXCR5和CXCR3的表达并改善了细胞回收率。图H和图I显示CXCR5和CXCR3的单染对照，图J显示在存在1% FBS的情况下单染ViaKrome 808，区分活细胞和死细胞的能力没有降低，图K显示CD3?CD4? T细胞，图L显示多色样本中恢复的CXCR5和CXCR3表达。注意：测试了多个变量，包括不同批次和货号的ViaKrome染料、CXCR5和CXCR3抗体以及FBS。然而，关键的改进是在ViaKrome染色前使用1% FBS洗涤观察到的。